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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷酸性反应绘制组学、LC-MS/MS磷酸性反应位点定性分析技术服务。
英文怎么说主题：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
中文名文章标题：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
顾客部门：山东大学
研究探讨文件：拟南芥侧根
拜谱出示技艺：磷过酸体现组学、LC-MS/MS磷过酸位点概述
调查总体目标：
PART 01 研究分析数据
01、滋生素催进VIK的磷硝化作用还有其转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷碱化蛋清质成分析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 发育素推动VIK的磷过酸和其转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷碱化实验操作。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过酒曲双杂交育种探讨（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶互补式影像工作（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且体内磷硝化作用实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。24小时化学发光法PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素数据信息主动调空 LR 健康
借助定量分析两只VIK T-DNA放入表观遗传变异体（vik-2和vik-3），看见与也是型相信，表观遗传变异体的LR比热容、LR原基（LRP）和已成长的LR不错提高，越发是vik-2（图2）。相对，过表述VIK的转表观遗传植物行为出LR比热容增添。与此同时，在vik-2表观遗传变异体原型下表述VIK的转表观遗传植物恢复原状了LR成长偏差。衍生素解决调查得出结论，vik-2表观遗传变异体对衍生素诱惑的LR成长反应迟钝减少，得出结论VIK在衍生素干预LR成长中引领重中之重使用。 
图2 VIK介导的发展素数据通道双向调节LR的成长
03、VIK 与ERF13 做工具互动
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双氧分子荧光互替 （BiFC）和免疫检测共沉淀物工作（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13主动角色
04、VIK以正反两面馈的具体方法调节作用ERF13磷碱化
通过磷过酸蛋清组学研究，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点变异会发现显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以正反两面馈方法磷碱化ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷酸性反应增进ERF13吸附
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过离体實驗设计和人体實驗设计，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸模拟网和磷酸解离基因突变体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚体细胞品牌定位浅析表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷酸性反应t加速了ERF13溶解
06、VIK 介导的 ERF13 磷过酸调整 LR 的出显
的研究进两步一起探讨了VIK调空的ERF13吸附在侧根（LR）发育状况中的做用。可以通过比与众区别转人类基因沉水蕨类绿植系的LR表型，出显过理解方式ERF13阻止用处了LR的出显，在vik基因突变体中在这类阻止用处做用促进会，而在过理解方式YFP-VIK的时代背景下在这类阻止用处做用衰弱（图6）。虽然，比ERF13的与众区别磷硝化作用模拟训练仿真和磷酸化学降解变种体的过理解方式沉水蕨类绿植系，出显ERF132A-Myc（磷酸化学降解）的沉水蕨类绿植系LR出显比较少，而ERF132D-Myc（磷硝化作用模拟训练仿真）的沉水蕨类绿植系LR出显略多。这类毕竟表达，VIK介导的ERF13磷硝化作用和吸附促进会了LR的出显。 
图6 VIK介导的ERF13磷硝化作用提高网站LR的显现
07、VIK在侧根发育期中磷过酸并平衡LBD18核蛋白
确认定性分析三个VIK T-DNA复制到表观遗传转变体（vik-2和vik-3），察觉到与野山型相较，表观遗传转变体的侧根（LR）体积、LR原基（LRP）和已发肓状况的LR同质性变少，特别的是vik-2（图7）。反而，过传达方式VIK的转表观遗传茎秆表面出LR体积增强。除此以外，在vik-2表观遗传转变体原型下传达方式VIK的转表观遗传茎秆恢复如初了LR发肓状况一些缺陷。萌发素治理科学试验显示，vik-2表观遗传转变体对萌发素诱导型的LR发肓状况反應变弱，显示VIK在萌发素调节效用LR发肓状况中树立重要的效用。 
图7 VIK 在LR成型全过程中真接磷硝化作用和不稳LBD18核蛋白
PART 02 论文个人总结
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷酸性反应血清质组学分折筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的植物生长素4g信号控制侧根型成
PART 03 拜谱总结
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的蛋清质组学、呈现蛋清质组学、代谢转化组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—非常高进一步DIA·磷过酸修饰语组，采用创新生物富集技术水平+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现绿色子子样本10w+、草木子子样本5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
学习资料：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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